細(xì)胞污染是生物實(shí)驗(yàn)室中常見的問題之一，輕則引起細(xì)胞狀態(tài)改變，降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性，重則會直接導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。因此，預(yù)防細(xì)胞污染，是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵點(diǎn)之一

如何控制細(xì)胞實(shí)驗(yàn)過程中的污染？本期內(nèi)容，為大家提供一些關(guān)鍵的方法和策略。

一、生物污染

細(xì)胞的體外生存環(huán)境，可以說是“危機(jī)四伏"。空氣中漂浮著各種肉眼難以捕捉的微生物，稍有不慎，細(xì)胞就會被感染。不僅如此，如果實(shí)驗(yàn)操作不夠規(guī)范，還有可能出現(xiàn)細(xì)胞交叉污染的情況。

1、細(xì)菌污染

細(xì)菌是一種原核細(xì)胞微生物，一般為微米級別。細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的污染菌為大腸桿菌、葡萄球菌、假單胞菌等。

細(xì)胞發(fā)生細(xì)菌污染后，有哪些癥狀？與其他污染相比，細(xì)菌污染在細(xì)胞培養(yǎng)過程中“發(fā)病"更為迅速，較容易被發(fā)現(xiàn)。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)如下癥狀時，基本可以斷定，細(xì)胞發(fā)生了細(xì)菌污染：

①細(xì)胞培養(yǎng)基在短時間內(nèi)迅速渾濁；

②靜置的培養(yǎng)液時不渾濁，但稍加震蕩，就有許多渾濁物漂起；

③顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮；

④細(xì)胞停止生長、出現(xiàn)大量死亡；

如果細(xì)胞不幸遭遇到了細(xì)菌污染的侵襲，該如何應(yīng)對呢？我們建議直接將細(xì)胞丟棄，并對培養(yǎng)環(huán)境消毒。國際上大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室會使用Mycoplasma-off™噴霧劑（或濕巾），對超凈臺、培養(yǎng)箱等環(huán)境進(jìn)行消殺。

2、支原體污染

支原體（mycoplasma）是一類沒有細(xì)胞壁、高度多形性、部分可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的原核細(xì)胞型微生物，大小為0.3微米左右。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，顯微鏡很難捕捉到它們的身影，與細(xì)胞競爭營養(yǎng)，影響細(xì)胞生長，最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)偏差，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)如下癥狀時，基本可以斷定，細(xì)胞發(fā)生了支原體污染：

①生長速率緩慢、活力下降、易脫壁；

②細(xì)胞形態(tài)改變；

③細(xì)胞易聚團(tuán)；

④在顯微鏡下，可見培養(yǎng)液中產(chǎn)生大量碎片（培養(yǎng)基不渾濁）；

⑤在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液很快變黃（意味著培養(yǎng)液中有看不見的大量微生物繁殖，營養(yǎng)被消耗）；

由于支原體體型微小，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，普通光學(xué)顯微鏡很難觀察到，只有在電鏡下才能拍到支原體的照片。細(xì)胞培養(yǎng)過程中的支原體污染，會大量消耗培養(yǎng)液中的營養(yǎng)。98%會附著在細(xì)胞表面，導(dǎo)致細(xì)胞生長狀態(tài)發(fā)生異常，甚至引起死亡，最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)生異常。

如果細(xì)胞被支原體污染，該如何處理？對與支原體污染的細(xì)胞，優(yōu)先考慮丟掉細(xì)胞，重新培養(yǎng)。

①對于非常珍貴的細(xì)胞株（不可再得的）國際上使用Mynox® Gold，做4周左右的支原體祛除持續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

②對于非常珍貴的細(xì)胞株或生物樣品（無法長期培養(yǎng)的），可使用Mynox®，對細(xì)胞做3小時左右的祛除支原體處理，處理完畢，沖洗細(xì)胞，將樣品放入潔凈的培養(yǎng)液中，重新培養(yǎng)或保存即可。

③對于已經(jīng)進(jìn)行到中途的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，如果將培養(yǎng)的大量細(xì)胞丟棄，會造成高昂的實(shí)驗(yàn)成本損失。對于這樣的情況，補(bǔ)救辦法如下：在培養(yǎng)液中加入10%的Zell Shield®（一種新型復(fù)合抗生素）。按照廠家建議的方法，配合處理細(xì)胞，培養(yǎng)4代以上，基本可祛除支原體污染。

④一些做原代培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)室，為了預(yù)防取原代細(xì)胞過程中可能會發(fā)生支原體污染，實(shí)驗(yàn)人員也可以在培養(yǎng)液中加入10%的Zell Shield®（一種新型復(fù)合抗生素），培養(yǎng)4代以上，即可撤掉Zell Shield®，此過程可有效預(yù)防支原體污染的發(fā)生。

3、真菌污染

真菌是一類具真核和細(xì)胞壁的異養(yǎng)生物。真菌可以通過孢子延續(xù)種群，典型的營養(yǎng)體為絲狀分支結(jié)構(gòu)。可污染細(xì)胞培養(yǎng)基的真菌種類繁多，最常見的有曲霉菌，白色念珠菌，酵母菌，黑霉菌，孢子菌等。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)上述癥狀時，基本可以斷定，細(xì)胞發(fā)生了真菌污染：

①在細(xì)胞培養(yǎng)液中會形成淡黃色或白色的漂浮物，肉眼可見，但培養(yǎng)液在短期內(nèi)不變混濁；

②顯微鏡下可以看見細(xì)胞之間或是培養(yǎng)液中，有縱橫交錯穿行的絲狀，樹枝狀或管狀菌絲；

③多數(shù)菌絲在高倍鏡下可以觀察到鏈狀排列的菌株，而念珠菌及酵母菌菌株呈卵圓形，散落在細(xì)胞上及細(xì)胞周邊生長。

細(xì)胞發(fā)生真菌污染時，需要將細(xì)胞丟棄，并對培養(yǎng)環(huán)境消毒，國際上大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室會使用Mycoplasma-off™噴霧劑，對超凈臺、培養(yǎng)箱等環(huán)境進(jìn)行消殺。

二、加強(qiáng)細(xì)胞間管理，是解決細(xì)胞污染真正有效的方法

匯總了各大實(shí)驗(yàn)室的工作流程：

1、在正式進(jìn)入細(xì)胞間前，需要在緩沖隔離間佩戴好細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室專用的防護(hù)用具：口罩、防護(hù)服、鞋套等，開始實(shí)驗(yàn)前，佩戴好手套。

2、定期使用Mycoplasma-off™噴霧劑（或濕巾），對工作區(qū)域消殺（建議半個月一次，但需根據(jù)細(xì)胞間實(shí)際使用頻率決定）。

3、每次實(shí)驗(yàn)開始前，和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用紫外線對細(xì)胞間進(jìn)行照射消毒，實(shí)驗(yàn)操作前用酒精或Mycoplasma-off™噴霧劑對操作人員的手套進(jìn)行噴涂消毒。

4、在水浴鍋或培養(yǎng)箱水槽的水中，加入0.5%的Water Shield™，可確保一個月內(nèi)水源不會變成支原體、真菌或細(xì)菌的污染源。

5、如果細(xì)胞間內(nèi)，發(fā)生多株細(xì)胞的聯(lián)合的支原體污染情況，建議在做上述1-4的操作的同時，將液氮罐，也用Mycoplasma-off™噴霧劑（或濕巾）進(jìn)行消殺，并更換潔凈的液氮，（液氮罐中凍存的細(xì)胞發(fā)生支原體污染，也會在液氮中引起污染的的傳播）。

上述內(nèi)容只分析了生物因素污染，在實(shí)際培養(yǎng)過程中，可能還會發(fā)生物理或化學(xué)污染，請自行排除，本文不再贅述。

三、使用高品質(zhì)的實(shí)驗(yàn)試劑，降低細(xì)胞污染風(fēng)險(xiǎn)

胎牛血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基補(bǔ)充物，以維持細(xì)胞的生長和健康。選擇高品質(zhì)的胎牛血清，可以盡可能降低細(xì)胞污染的風(fēng)險(xiǎn)。

高品質(zhì)的胎牛血清，血源清晰、通過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，并在檢測報(bào)告上，表明批次、內(nèi)毒素含量、無菌檢測和病原檢測情況、蛋白含量等指標(biāo)，清晰且明確。以科研人常用的Ausbian進(jìn)口特級胎牛血清為例，澳洲血源，內(nèi)毒素含量≤3EU/ml，無菌檢測和病原檢測結(jié)果均為“未檢出"病毒和細(xì)菌，蛋白含量也有注明，品質(zhì)如何，一目了然！