- 優(yōu)質血清助力細胞學實驗 -

上期內容里，我們介紹了細胞轉染的基本基本知識，包括概念、應用場景以及各種方法之間的優(yōu)劣對比。

本期內容，進一步為大家介紹常用的細胞轉染方法——實操篇。

- 細胞轉染常用方法 -

陽離子脂質體介導的轉染

原理：陽離子脂質體介導的轉染是目前常用的轉染方式之一。

陽離子脂質的基本結構由帶正電荷的頭基和一個或兩個烴鏈組成。

帶正電荷的頭基與帶負電荷的核酸通過靜電作用形成復合物。

經(jīng)細胞的內吞作用進入細胞。

實驗過程：將DNA，RNA，siRNA或寡核苷酸和轉染試劑分別在不同的管中稀釋→將兩者混合形成混合物→將形成的混合物加入細胞中，脂質體的正電荷有助于幫助復合物粘附到細胞膜上→復合物經(jīng)細胞內吞作用進入細胞→檢測基因表達或沉默情況。

磷酸鈣共沉淀

原理：將DNA與氯化鈣在磷酸緩沖鹽水中混合形成磷酸鈣-DNA沉淀物，然后將其分散在培養(yǎng)的細胞上，磷酸鈣促進共沉淀物中的縮合DNA與細胞表面的結合，DNA通過內吞作用進入細胞。

實驗過程：將氯化鈣和DNA混合，以可控的方式加入磷酸緩沖液→在室溫下孵育，以形成極細，可溶的共沉淀微粒→將磷酸鈣-DNA沉淀物加入細胞中，后者能黏附到細胞膜表面→共沉淀物經(jīng)細胞內吞作用進入細胞→檢測基因表達或沉默情況。

病毒轉染

原理：對于用脂質體不能實現(xiàn)轉染的細胞，可以采用病毒轉染。腺病毒，逆轉錄病毒和慢病毒載體已廣泛用于哺乳動物細胞體內外的基因轉染。

 

實驗過程：通過基因克隆方法獲得重組病毒表達載體→轉染包裝細胞系，擴增并分離得到重組病毒顆粒→純化并滴定病毒液→轉導目的細胞（含病毒特異性的受體）→從培養(yǎng)基中移除病毒→檢測基因表達或沉默情況。

電轉

原理：利用電脈沖在細胞膜上形成暫時的孔使核酸物質能穿過孔進入細胞。

實驗過程：利用電轉緩沖液重懸細胞→對含有核酸，緩沖液，細胞的混合物給予合適的電脈沖→電脈沖在細胞膜上形成電勢差，誘導產(chǎn)生暫時的孔使核酸進入細胞→將細胞返回到生長培養(yǎng)基中，使其慢慢恢復→檢測基因表達或沉默情況。

血清在細胞培養(yǎng)過程中的重要性不言而喻：

• 提供對維持細胞指數(shù)生長的激素，基礎培養(yǎng)基中沒有或量很少的營養(yǎng)物，以及主要的低分子營養(yǎng)物。

• 提供結合蛋白，能識別維生素、脂類、金屬和其他激素等，能結合或調節(jié)它們所結合的物質活力。

• 有些情況下結合蛋白質能與有毒金屬和熱原質結合，起到解毒作用。

• 是細胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質上所需因子來源。

• 起酸堿度緩沖液作用。

• 提供蛋白酶抑制劑，使在細胞傳代時使剩余胰蛋白酶失活，保護細胞不受傷害。

• 參與細胞凍存。

• ......

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