細胞培養是一種無菌技術，要求工作環境和條件必須保證無微生物和不受其他有害因素的影響。為防止微生物污染和有害因素的影響，細胞培養室要求環境清潔，空氣清新、干燥、無塵。

細胞培養實驗室由無菌操作區、孵育區、制備區、儲藏區、清洗和消毒滅菌區6部分組成，這些區域的共同特點是房間要寬敞、明亮，地面要便于清潔、防滑，墻壁的質地光滑堅硬，儀器設備布局合理，方便操作，避免交叉干擾，陳設簡潔，便于清掃。

一、無菌操作區

無菌操作區是只限于細胞培養及其他無菌操作的區域，最好能與外界隔離，不能穿行或受其他干擾。在一般環境的空氣中，由于存在許多塵埃和雜菌，較易造成污染。

因此，接種工作要在空氣經過滅菌的環境里進行，小規模的無菌環境可利用超凈工作臺創造，大規模的需建無菌室。

理想的無菌操作室應劃為三部分：

1. 更衣室―供更換衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。

2.緩沖間―位于更衣間與操作間之間，用于準備工作，還有防止污染的作用，以保證操作間的無菌環境，同時可放置恒溫培養箱以及必需的小型儀器。

3.無菌操作間―無菌操作間則專用于無菌操作、細胞培養，其大小要適當，且其頂部不宜過高以保證紫外線的滅菌效果；墻壁光滑*以便清洗和消毒，無菌操作間容積小且為密閉式，一般無菌操作間的空氣消毒用紫外線燈，有的實驗室使用無臭氧紫外線消毒器或電子消毒滅菌器。

凈化工作臺：操作簡單，安裝方便，占用空間小且凈化效果很好。一般細菌培養室使用的凈化工作臺主要有兩種：

（1）側流式或稱垂直式。

（2）外流式或稱水平層流式。

二、孵育區

孵育區也稱培養區，本區對無菌的要求雖不比無菌區嚴格，但仍需清潔無塵，因此也應設置在干擾少而非來往穿行的區域。孵育可在孵箱或可控制溫度的溫室中進行，后者費用高，一般實驗室多采用孵箱進行工作。

三、制備區

制備區主要進行培養液及有關培養用的液體等的制備。應設有試劑柜、器械柜、實驗臺和上水道、電源等，配備的主要儀器設備有水純化裝置、天平、微波爐、pH計、抽氣泵、電爐、培養分裝器、各種規格的培養瓶、培養皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶等。

在有天平、pH計、磁力拌器等設備下完成制備以后，應在無菌操作臺進行過濾除菌。液體制備直接關系組織細胞養的成敗，因此必須嚴格無菌操作。

四、儲藏區

儲藏區主要存放各類冰箱、干燥箱、液氮罐、無菌培養液、培養瓶等，此環境也需要清潔無塵。為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般為液氮溫度-196℃。

細胞的凍存過程需要一系列程序降溫，一般為4 ℃下存放30min。轉放-20 ℃ 1 h，再轉入-80—-70℃過夜，之后才可以轉移到液氮內(-196℃)。因此儲存區必須配備冰箱、低溫冰箱、超低溫冰箱和液氮罐等設備。

五、清洗和消毒滅菌區

清潔和消毒滅菌區應與其他區域分開，主要進行所有細胞培養器皿的清洗、準備、消毒及三蒸水制備等工作，應備有高壓蒸汽滅菌鍋、細菌過濾設備、電熱干燥箱、消毒柜、排風設備等。

六、細胞實驗室的建設要求

1.環境要求

溫度：儀器還是操作對溫度沒有特殊要求，維持舒適的溫度即可，比如18~26度。

濕度：過高的濕度會導致微生物的滋生，所以建議正常維持濕度在70%以下。

潔凈度：細胞實驗對潔凈區并沒有要求，細胞實驗里面只有細胞操作的時候要求無菌的環境，這時要求有局部的百級，通常可以利用超凈臺或者生物安全柜來實現，不過有時候為了有個更好一點的環境，減小超凈臺過濾器更換的時間，會維持室內的潔凈度，比如萬級的潔凈度。

無菌無毒的操作環境和培養環境是保證細胞在體外培養成功的首要條件。細胞培養對無菌環境要求很高，在細胞操作時，一般需要在100級空氣質量條件下進行。

在體外培養的細胞由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質污染，或者自身代謝物質積累，可導致細胞中毒死亡。

照明：滿足實驗用的操作照度，通常在300LUX。

2.圍護結構要求

雖然實驗的操作對大環境沒有特殊要求，不過最好能有不產塵、不積塵的環境，能保證室內的清潔，并且易于清洗、不容易滋生微生物，所以在選擇維護結構時，選用彩鋼板、醫療板等潔凈板材是比較好的選擇，為了保證室內的通透性，可以布置密閉窗。

3.消毒

通常做完實驗后，都需要做終末消毒，室內需要安裝紫外燈，利用紫外燈對空氣和表面消毒。

德國MB生產的Mycoplasma-offTM噴霧劑，或濕巾擦拭 5-10分鐘清除，對支原體、細菌、真菌、霉菌、孢子祛除確切有效。無殘留, 無腐蝕, 無致癌性，操作簡單方便。

qPCR法介紹：

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規PCR基礎上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標記，使PCR擴增后的產物帶有熒光，利用熒光信號的變化和配套軟件，進行DNA擴增反應的實時監測，簡稱qPCR。

優點：①靈敏度高、特異性強。

②時間短，2-3小時出結果。

③檢測結果可定量。

④操作簡便。

缺點：①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結果會出現假陽性。（可用培養法做補充驗證）

②不同廠家生產的試劑盒質量差異巨大（由于引物及內在設計不同），需謹慎選擇，盡量在專業人員推薦指導下使用。